涉及miRNA的研究主要是建立miRNA、作用靶点和生物学功能之间的关系,三者都可作为切入点展开研究,本次我们介绍从目标miRNA开始的常用研究策略。
(1)寻找目的miRNA
① miRNA qRT-PCR检测
在病理组织、血液等样本中准确检测候选miRNA的表达谱,可有助于分析miRNA与疾病等条件的相关性,用于开发miRNA作为生物标志物;进一步,也可以寻找miRNA变化影响的靶基因表达变化。
② miRNA表达芯片谱检测
MicroRNA芯片检测服务是检测样本总RNA中miRNA表达谱,筛选出差异表达共表达的miRNA。
(2)预测靶基因以及靶基因功能
MicroRNA与靶基因的相互作用可以通过targetscan(http://www.targetscan.org/)、miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)等数据库进行预测。不同的数据库的计算方法存在差异,可以结合多个数据库的结果进行预测。
预测到下游靶基因后,可以结合DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进一步了这些基因所涉及的功能以及信号通路。
(3)确定靶关系以及miRNA功能
体外实验中,利用qRT-PCR、荧光素酶报告质粒、RIP-Seq等方法,在改变miRNA丰度的情况下验证所预测的靶基因,确定其是否为miRNA的真实靶点;观察细胞表型变化,例如增殖、凋亡、侵袭转移等,和基因的表达分析相结合。
进一步,通过体内实验,构建功能获得(gain of function,GOF)和功能失活(loss of function,LOF)动物模型,利用miRNA agomir或者miRNA antagomir等调节动物体miRNA表达水平,从而验证其作用机制。
研究也可以从感兴趣的基因出发,寻找确定以该基因为靶向的miRNA,最后判断其功能;也同时,也可以将特殊的功能或者表型作为切入点,进而筛选引起这些变化的miRNA或者基因,最后寻找引起这些变化的基因或者miRNA。无论选择哪个切入点,研究最终的目的都是要阐明miRNA-靶基因-功能三者之间的关系。